이번에 1학년 생물 방과후 실험에서 “PGLO 단백질의 발현”이라는 주제로 실험 준비를 진행하게 되었다. 실험을 진행하기 위해선 구매한 500µl PGLO 균주와 500µl JM109 균주를 LB Broth(액체 배지)에 배양시켜 실험에 사용할 만큼 양을 늘리고 실험 전까지 균주에 이상 없이 보관해야했다.
문제가 생겼다.
시험 기간동안 방과후가 운영되지 않아 실험까지 한 달 넘는 시간동안 균주를 보관해야 했던 것이다. 효율적이고(마음에 여유가 없던 시험 기간에 최대한 쉽고, 시간 낭비가 적은), 세포가 손상받지 않고 장기간 보관할 수 있어야 했으며, 지금 내가 사용할 수 있는 재료를 이용해 보관할 수 있어야 했다.
대강 계획을 세우고 나는 바로 인터넷 검색을 통해 적합한 균주 보관 방법을 찾아보았다.
균주 보관 방법에는 크게 3가지가 있다.
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계대배양법
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유동파라핀을 이용한 산소 공급 차단
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동결/건조를 통한 미생물의 대사 활동 억제
이 중에 일정 기간마다 균주가 자라는 배지를 옮겨 영양분을 공급해주는 계대배양법을 많이 사용해봤지만 장기간 보관하기에 어려움이 있어 이번엔 동결/건조를 통해 균주를 보관하고자 했다.
(아래부터는 균주 보관 방법에 대한 설명이다.)
Glycerol을 이용한 균주 보관
” 그냥 냉동시키면 안 되는건가? ‘’
굳이 Glycerol을 사용해야하나?
냉동 과정에 물의 결정화가 진행되면 얼음 결정이 생기는데, 이런 얼음 결정은 세포 내부의 소기관 파괴나 외부로부터의 충격으로 인한 세포 자체 문제의 원인이 된다. 새포에 문제가 생긴 균주는 사용이 불가할 뿐 아니라 잘못된 실험 결과를 도출해낼 수 있어 사용이 불가능하다.
” 그럼 Glycerol을 사용하는 이유는 무엇인가? “
물의 결정화로 인해 생기는 얼음 결정이 문제라면, 얼음 결정이 안 생기게, 덜 생기게 하면 되지 않을까?
이때 Glycerol과 같은 “동결 보존제”는 물과 수소결합을 형성해 상대적으로 물의 결정화가 잘 이루어지지 못하게 한다. 즉, 세포 동결 시 세포의 손상을 막아주는 역할을 한다.
Glycerol을 이용한 균주 보관 방법
Glycerol을 이용한 균주 보관 방법의 장점은 매우 간단하다. 다른 전처리 과정 없이 멸균된 glycerol과 증류수를 일정 비율로 섞고 균주를 첨가해 동결 시키면 된다.
(다음은 구체적인 보관 방법이다.)
1) 50% glycerol 용액을 만든다.
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glycerol 희석액과 보관할 균주를 각각 7:3 비율로 micro tube에 넣어준다.
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vortexing 또는 pipetting을 통해 잘 섞어준다.
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tube에 해당 균주에 대한 정보를 기재한 뒤 deep freezer(-80’C)에 보관한다.
Glycerol을 이용한 균주 보관 시 주의할 점
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균을 보관하기 전 활성이 좋은 균을 사용한다.
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균 보관 목적에 따라 균의 종류, 확실히 원하는 균인지, 균이 오염되지는 않았는지 확인한다.
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보관된 균을 사용 시 항상 다른 균과의 오염을 주의하고, 장시간 동안 실온에 방치하지 말아야 한다.
실험 과정에 있어 균주 보관은 기본 중의 기본이자 필수적으로 숙지 해야 하는 중요한 과정이다.
잘 보관하면 실험 진행의 시간과 비용을 많이 아낄 수 있지만 반대로 잘못 보관하면 애써 진행한 실험 데이터를 모두 잃을 수 있기 때문에 정확한 방법으로 균주를 보관하는 것은 매우 중요하다.