단백질 전기영동법, SDS-PAGE

단백질은 핵산$^{1)}$, 지질, 물과 함께 생명체를 구성하는 가장 중요한 구성 성분 중 하나입니다. 머리카락, 피부, 근육 등 우리 몸을 구성하는 세포들의 많은 부분이 단백질로 이루어져 있을 만큼, 단백질은 생명체에 없어선 안 될 핵심 요소입니다. 하지만 분자량이 큰 편에 속하는 단백질도 여전히 눈에 보이지 않을 만큼 작습니다.

이는 눈에 보이지 않는 단백질을 검출, 분리하는 실험을 진행하는 것이 어려운 이유입니다. 실제로 SDS-PAGE가 개발되지 않았을 때에는 효소$^{2)}$(단백질)에 대한 기질$^{3)}$(리간드)의 활성을 살펴봄으로써 단백질을 정제하기도 하였습니다. 그러나 이 방법은 정확하지 않아 어떤 단백질이 존재하는지를 확인하는 것이 어렵습니다. SDS-PAGE는 Ulrich K.Laemmli에 의해 개발된 단백질 정제 기술로, 현재까지도 널리 쓰이는 방법입니다.

1) 핵산(nucleic acid)은 유전 물질인 DNA, RNA를 포함하는 물질들의 분류를 말합니다.

2) 화학 반응의 속도를 증가시키는 생체 촉매입니다.

3) 다른 말로는 반응물이라고도 하며, 화학 반응 시 반응하여 생성물을 만드는 물질을 말합니다.

1. 겔 전기영동(Gel Electrophresis)이란?

겔 전기영동은 DNA, RNA, 단백질 등 생체 거대분자들, 혹은 그 조각들을 크기나 전하에 따라서 나누고 분석하는 기법을 말합니다. 이 중 단백질을 전기영동을 이용해 분석하는 경우 단백질 전기영동(Protein Electrophoresis)라고 합니다. 본문에서 자세히 다룰 SDS-PAGE는 단백질 전기영동법의 한 종류입니다.

2. SDS-PAGE란?

SDS-PAGE는 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis의 약자로, 단백질을 분자량에 따라 분리하는 기술을 말합니다. SDS-PAGE는 주로 5~250kDa 에 해당하는 분자량을 갖는 단백질들을 분리하는 데 사용됩니다. (1 Da는 1원자질량(1 atomic mass; 1u )을 말합니다. 즉 1kDa = 1000Da = 1000u입니다.)

SDS-PAGE에서 SDS는 Sodium Dodecyl Sulphate로, 우리말로는 도데실 황산 나트륨입니다. SDS는 음이온성 계면활성제$^{4)}$로, 피부에 염증을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 값싼 가격 덕분에 샴푸, 비누 등에 함유되기도 했으나 인체에 유해함이 밝혀진 후에는 우리나라에서 사용 금지 물질로 지정되었습니다. SDS의 구조식은 다음과 같습니다. 친수성과 소수성 부분을 모두 포함하는 것을 확인할 수 있습니다.

4) 물에 녹았을 때 친수성 부분이 음이온을 따는 것을 말합니다. 보통 친수성기는 카르복실기(-COOH, carboxylate), 황산염(-SO42- ,sulfate), 술폰산염(RSO3-, sulfonate), 인산기(PO43-, phosphate)로 이루어져 있습니다.

3. SDS-PAGE의 원리 (I) : 화학적 결합 측면에서

단백질은 저마다 고유한 구조와 전하, 질량을 가집니다. SDS-PAGE에서는 단백질을 질량의 차이에 의해서만 분류해야 하므로, 전하와 질량의 영향을 실험 과정에서 제거하는 과정이 필수적입니다.

1) SDS-PAGE에서 SDS의 역할

단백질 전기영동에서 투입된 SDS는 단백질과 약 의 질량비로 결합을 이룹니다. 개수로 따지면 SDS 1분자는 2개의 아미노산과 결합합니다. SDS는 상술한 것처럼 계면활성제(surfactant)로 작용하여, 단백질의 고유한 전하를 가리고(차단하고) 단백질들이 유사한 비전하$^{5)}$를 가질 수 있도록 합니다. 단백질들의 고유한 전하는 SDS의 큰 전하에 비하면 무시할 수 있는 정도이기 때문에, SDS를 처리하면 단백질들은 일시적으로 음전하를 띠게 됩니다.

SDS는 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC; Critical micellar concentration)라는 특정 농도 이상이 되면 구 형태의 미셀을 형성하게 됩니다. 미셀(micelle)은 계면활성제가 일정 농도 이상에서 모인 집합체로, 소수성 부분이 안쪽으로 모여서 핵을 형성하고, 친수성 부분이 물과 닿는 표면을 형성하는 구조를 가집니다.

보통 용액에서 임계 미셀 농도는 7~10mM 정도인데, 이 농도 위에서 SDS는 단일 분자(monomer)와 미셀의 두 상태로 나타납니다. 그리고 이 농도 밑에서는 오직 단일 분자 상태로만 나타납니다. 이때 오직 단일 분자 상태의 SDS만이 단백질과 결합할 수 있습니다. 이와는 달리 미셀 상태의 SDS는 바깥에 음전하를 띠어서 어떤 단백질과도 결합할 수 없습니다.

이때 SDS는 자연 상태에서 양친매성$^{6)}$이기에, 단백질 구조의 극성 부분과 비극성 부분에 모두 결합할 수 있습니다. 이런 성질에 힘입어 SDS는 단백질의 접힌 구조를 펼 수 있게 도와줍니다. SDS의 농도가 0.1mM 이상이 되면 단백질이 펴지기 시작하고, 1mM 이상이 되면 대부분의 단백질이 펴지게 됩니다. 이 이후엔 단백질이 모두 펴져서 단백질의 4차 구조는 거의 찾아볼 수 없게 됩니다.

-S-S- 등의 공유 결합을 포함하는 경우, SDS가 있음에도 불구하고 안정적으로 구조를 형성하고 있는 단백질이 존재할 수 있습니다. 이를 펴기 위해 열을 가할 수도 있지만, 단백질 전기영동에 사용되는 Sample Buffer에 DTT$^{7)}$, 혹은 Mecraptoethanol$^{8)}$이 첨가되어 있어 이황화 결합도 끊어지게 됩니다. 즉 단백질은 일차 구조를 형성하여 이동합니다. DTT와 Mectoptoethanol의 구조식은 다음과 같습니다.

다음은 SDS에 의해 단백질의 펴짐(unfolding)이 진행되는 모식도입니다.

2) SDS-PAGE에서 Polyacrylamide gel의 역할

뒤에서 언급할 SDS-PAGE 장치의 구조를 보면, 이 장치는 단백질을 겔 사이로 통과시킨 뒤 단백질이 겔에서 이동한 정도와 양이 다른 것을 이용해 단백질을 분리하는 원리를 가집니다. 여기서 사용되는 겔은 Polyacrylamide Gel입니다. Polyacrylamide Gel은 겔 내부에 균일한 크기의 공극9)을 형성하여 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 겔 내부 공극의 크기(공극률, porosity)는 겔을 제작할 때 사용되는 Acrylamide와 Bis-acrylamide powder의 농도를 다르게 하여 조절할 수 있습니다. Acrylamide와 Bis-acrylamide의 구조식은 다음과 같습니다. 동시에 Acrylamide는 신경 조직에 위해를 가할 수 있는 물질이므로 실험 중에 주의가 필요합니다.

3) 단백질 전기영동의 시행

이제 SDS를 첨가하여 단백질이 선형 구조로 바뀌었으므로 분자량(혹은 아미노산의 수)에 따라서 단백질을 분리할 수 있습니다. 전류를 겔을 통해 흐르게 하면 음전하를 띠는 단백질은 양극으로 이동하게 됩니다. 이때 단백질의 크기에 따라서 단백질이 겔의 공극을 통과하는 양상이 달라집니다. 크기가 작은 경우 공극을 통과해 더 멀리 이동하게 됩니다. 이런 특성을 이용하면 일정 시간이 지난 후 단백질들이 서로 다른 거리를 이동한 것을 관찰할 수 있습니다. 크기가 작을수록 원점에서부터 더 먼 거리를 이동합니다.

4) 검출

전기영동된 시료는 눈에 보이지 않기에 염색 처리를 해주어야 합니다. 일반적으로 사용되는 염색약은 CBB(Commassie Brilliant Blue)입니다. 이 방법은 용액 속에 겔을 담궈두기만 해도 염색이 아루어지는 간단한, 그리고 저렴한 방법으로 널리 사용됩니다. 이 외에도 Amido Black 10B라는 염색약도 사용됩니다. 이때 이 두 염색약은 아세트산과 메탄올이 존재할 때 염색과 탈색이 이루어지므로 두 물질을 포함하는 Staining Solution을 겔에 처리합니다.

5) 해석

이미 분자량을 알고 있는 단백질의 이동도를 측정해 검량선을 만들고 이를 이용해 분자량을 측정할 수 있습니다. 카메라로 촬영하거나 전문 소프트웨어로 해석할 수도 있습니다.

5) 전하-대-질량 비(charge-to-mass)로, 전하와 질량 간의 비율을 말합니다.

6) 친수성과 소수성 부분을 모두 가집니다.

7) Dithiothreitol ((2S,3S)-1,4-Bis(sulfanyl)butane-2,3-diol)

8) 2-Mercaptoethanol (HOCH2CH2SH)

9) 물질이 지나다닐 수 있는 구멍을 말합니다.

4. SDS-PAGE의 원리 (II) : pH와 이온들의 이동 속도의 측면에서

단백질 전기영동에서 단백질이 이동하는 경로인, 핵심적 요소라고 할 수 있는 Acrylamide Gel은 실제로 Stacking Gel과 Running Gel(Resolving Gel)의 두 층으로 이루어져 있습니다. 둘은 조성에서는 별다를 것이 없지만 pH의 차이가 둘을 구별한다고 할 수 있습니다. 우선 SDS-PAGE의 원리에 대해 이해하기 위해 등전점에 대해 알아보도록 합시다.

1) 등전점 (isoelectric point, pI, IEP)

등전점이란, 다양성자 산에서 평균 전하가 0이 되는 pH를 말합니다. 등전점은 기호로 pH(I), 혹은 pI로 표기합니다. HA라는 물질은 수소 이온(H+)을 받아 H2A+가 될 수도 있지만, 수소 이온을 잃고 A-가 될 수도 있습니다. 이때 H2A+가 되면 상대적으로 양전하를 띠지만, A-가 되면 음전하에 가까워집니다. 등전점은 양전하가 발생하는 화학 반응과 음전하가 발생하는 화학 반응이 상쇄되어 평균 전하가 0이 되는 지점입니다. 다양성자산을 편의상 H2A+라고 하면, 위에서 언급한 두 화학 반응의 식은 다음과 같습니다.

① ②

이때 평형 상태에서 화학평형의 식을 쓰면 이고 임을 알 수 있습니다. 이때 등전점에서는 평균 전하가 0이어서 이므로, 이를 적용하면 고, 따라서 가 됩니다. 정리하면, 가 되어 등전점은 두 이온화 상수 Ka1과 Ka2에 의해 결정되는 것을 알 수 있습니다.

어떤 분자의 알짜 전하는 분자를 둘러싸고 있는 주변 환경의 pH에 따라 변할 수 있습니다. 양성자(H+)를 얻거나 잃어서 전하가 변하기 때문입니다. 등전점은 주변 환경의 pH가 주어졌을 때 해당 물질이 양전하를 띨지, 음전하를 띨지를 알려주는 척도가 됩니다. 단백질은 대표적인 양쪽성 물질$^{10)}$이기에, 단백질에도 이를 적용할 수 있습니다. pH보다 pI가 큰 경우, 단백질은 수소 이온이 과잉이므로 양전하를 띠고, pH가 pI보다 큰 경우 단백질은 반대로 음전하를 띱니다.

2) 단백질 전기영동에서의 이온 이동 – Stacking Gel에서의 이온 이동

단백질 전기영동을 실시할 때는 우선 SDS-PAGE Gel을 준비한 뒤, 이를 SDS Running Buffer라는 용액과 함께 전기영동 세트에 넣어야 합니다. 이 과정을 끝마친 뒤, 최종 단백질 샘플을 겔에 투입(loading)하고 전기장을 걸어주면, 여러 이온들이 겔 속을 이동하며 전기영동 과정이 진행됩니다.

상술한 SDS Running Buffer에는 두 가지 중요한 이온들이 첨가되어 있습니다. 바로 염소 이온(Cl-)과 글리신(Glycine) 이온$^{11)}$입니다. 이 이온들은 단백질과 마찬가지로 겔에서 이동하게 됩니다.

앞에서 Acrylamide Gel이 Stacking Gel과 Running Gel로 구분된다는 것을 언급하였습니다. 이때 Stacking Gel의 pH는 6.8로 맞춰주며, 글리신 이온의 pI 값은 5.97이므로 이러한 환경에서 이온은 pH가 pI보다 크므로 음전하를 띠게 됩니다. 다음은 SDS-PAGE의 구조입니다. Stacking Gel과 Running Gel이 붙어 있고, 각각에 음극과 양극이 연결되어 있는 것을 확인할 수 있습니다.

Stacking Gel에서 염소 이온과 글리신 이온, 단백질은 모두 음전하를 띱니다. 그러나 염소 이온와 글리신 이온의 겔에서의 이동 속도는 다른데, 이는 두 가지 원인이 있습니다. 첫 번째는 염소 이온의 분자량이 적어 움직이는 속도가 빠르기 때문이고, 두 번째는 글리신 이온의 pI가 pH와 가까워 일부 글리신 이온만이 음전하를 띠기 때문입니다. 따라서 이동 속도를 측정해보면 이동 속도가 빠른 순서대로 염소 이온, SDS protein sample, 글리신 이온이 됩니다. 여기서 염소 이온과 글리신 이온의 이동 속도 차이는 다른 부가적인 효과를 줍니다.

두 이온의 이동 속도의 차이는 두 이온간의 거리를 증가시키고, 이는 Stacking Gel 내의 전하 분포가 양쪽으로 보다 치우치게 합니다. 그 결과로 염소 이온과 글리신 이온 사이에는 높은 전위차가 생기게 됩니다. SDS protein sample은 두 이온의 사이에 위치하며, 이 경우 SDS protein sample 앞으로는 염소 이온이 전기장을 받아 움직이고 있고, 뒤로는 글리신 이온이 같은 방향으로 움직이고 있다고 생각할 수 있습니다. 높아진 전위차에 의해 단백질의 이동 속도가 빨라지고, 이 작용에 의해 다시 글리신 이온의 이동 속도도 빨라지게 됩니다. 빨라진 글리신 이온은 단백질을 뒤에서 계속 ‘누르게’ 되며, 결국 단백질들의 이동 속도는 전보다 더욱 빨라져 대부분의 단백질은 동일한 속도로, 일직선상으로 움직이게 됩니다. 그 결과, 단백질들은 Running Gel에 들어가기 전에 거의 같은 출발선상에 놓이게 됩니다.

3) 단백질 전기영동에서의 이온 이동 – Running Gel에서의 이온 이동

Running Gel의 pH는 8.8로 높으며, 따라서 Running Gel에서는 pH가 글리신의 pI보다 큰 폭으로 크므로 글리신은 완전히 이온화됩니다. 글리신의 이동 속도가 증가하였으므로, 염소 이온, SDS protein sample, 글리신의 이동 속도를 비교해 보면 아까와는 달리 속도가 빠른 순서대로 염소 이온, 글리신, SDS protein sample이 됩니다. 즉 Stacking Gel에서 형성되었던 염소 이온과 글리신 이온 사이의 높은 전위차는 Running Gel에서는 생기지 않습니다. 이제 단백질의 이동은 해당 단백질의 분자량에만 영향을 받게 됩니다. 즉 분자량에 따라서 단백질들을 나누어 정렬하고, 분석할 수 있게 됩니다.

참고로 Running Gel에서 Acrylamide의 농도는 Stacking Gel에서의 Acrylamide의 농도보다 높기에 단백질들의 이동 속도의 차이가 더욱 극명하게 드러납니다. 한편 이를 달리 말하자면 Acrylamide의 농도를 조절하여 분자량이 큰 단백질이 빠르게 이동하게 하거나, 분자량이 작은 단백질이 느리게 이동하게 하는 것이 가능함을 의미합니다. 즉 Acrylamide의 농도는 protein sample에 따라 적절히 선택되어야 합니다.

10) (특히 브뢴스테드-로우리 산-염기 개념에서) 산으로도 작용할 수 있고, 염기로도 작용할 수 있는 물질을 말합니다.

11) 20개의 기본 아미노산 중 하나로, 약어로는 G나 Gly를 사용하며 동물의 단백질에서 흔히 발견되는 물질입니다. 글리신은 GGU, GGC, GGA, GGG의 코돈으로 암호화됩니다.

5. 단백질 전기영동의 특성을 표현하는 공식

1) 단백질의 이동 속도

단백질에 작용하는 힘은 전기력(F=qE)과 마찰력(F=kv)으로, 두 힘이 같아서 등속으로 운동한다고 볼 수 있습니다. 이때 운동 방정식은입니다. 정리하면 이동 속도가 됩니다. 단 q는 분자의 알짜 전하, k는 마찰계수입니다.

2) 겔의 마찰 계수

겔의 마찰 계수는 유체가 유체 내부를 지나가는 작은 물체에 가하는 힘을 표현하는 Stokes’ Law를 적용하면 와 같습니다. 이때 이 힘은 마찰력인 kv와 같으므로 정리하면 마찰 계수인 것을 알 수 있습니다. 단, μ는 용매의 점도이고 R은 분자의 반지름입니다.

6. 단백질 전기영동 과정에서 필요한 다른 시약들에 대한 간단한 설명

SDS-PAGE의 전반적 원리는 위에서 설명한 것과 같으나, 실제 SDS-PAGE 실험을 진행할 때는 몇 가지 시약이 더 필요합니다. 아래는 해당 시약들이 어떤 이유로 첨가되는지를 간단히 적어놓은 것입니다.

1) D.W.

Distilled Water의 줄임말로, 증류수를 의미합니다.

2) Tris

정식 명명법은 tris(hydroxymethyl)aminomethane로, (특히 핵산이 들어 있는) 완충 용액을 제조하는 데 사용됩니다. 이 완충 용액은 7.1과 9.1 사이의 pH 범위를 갖고 있으며 생화학과 분자생물학에서 완충 용액으로 자주 사용됩니다. Tris의 구조식은 다음과 같습니다.

3) APS

Ammonium Persulfate의 약자로, 우리말로는 과황산암모늄입니다. 과황산암모늄은 강력한 산화제이면서 동시에 라디칼을 쉽게 생성할 수 있는 분자입니다. APS는 전기영동 시 라디칼$^{12)}$을 형성하여 Arcylamide와 Bis-Arcylamide의 중합체를 형성합니다. 그 구조식은 다음과 같습니다.

4) TEMED

TEMED는 테트라메틸에틸렌다이아민(Tetramethylethylenediamine)의 약자로, 무색의 액체이며 금속 이온의 리간드로 흔히 사용되는 물질입니다. 전기영동 시 TEMED는 APS가 자유 라디칼을 생성하는 것을 촉매하여, Acrylamide와 Bis-Acrylamide 간의 중합체 형성을 촉진합니다. 그 구조식은 다음과 같습니다. (TEMED는 다른 명명법으로 N,N,N′,N′-Tetramethylethane-1,2-diamine라고 불리기도 합니다.)

12) 자유반응기라고도 하며, 짝을 짓지 않은 홀전자를 갖고 있어 반응성이 높다는 성질을 갖는 분자입니다.

7. 다른 방식의 단백질 전기영동 종류에는 무엇이 있을까?

1) 등전점 전기영동 (IEF)

단백질의 등전점(pI)는 어떤 이온성 아미노산을 갖고 있느냐에 따라 결정됩니다. 등전점에서 단백질은 움직이지 않으므로, pI에 따라 단백질을 분류한다면 같은 이온성 아미노산을 갖고 있는 것끼리 모을 수 있습니다. 단백질 전기영동은 낮은 pH에서부터 높은 pH까지를 크로마토그래피와 유사하게 단백질을 분류하는 것으로 비유할 수 있습니다.

2) 2차원 전기영동(Two-dimensional electophoresis)

2차원 전기영동은 SDS-PAGE와 등전점 전기영동법을 합쳐 단백질을 분리하는 기술을 말합니다. 평면 위에서 전기영동을 실시하여 x축으로는 등전점 전기영동을, y축으로는 SDS-PAGE법을 실시하여 단백질을 질량별로, 그리고 등전점별로 분류합니다. 이를 이용하면 단백질체를 분석할 수 있습니다.